可能原因 1：引物問題（包括：引物設(shè)計較差，引物合成較差，引物濃度太低）。

解決方法：設(shè)計引物的時候，避免在引物 3'端含有互補(bǔ)序列；避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；設(shè)計 Tm 類似的引物。針對引物合成的問題，用普通電泳法，看引物的設(shè)計和合成質(zhì)量，是否有目的條帶出現(xiàn)。最佳引物濃度介于 0.1μM 到 0.5μM 之間。

可能原因 2：探針問題。

解決辦法：就要用到我們前面提到的序列分析了。用 blast 對探針序列進(jìn)行比對，設(shè)計符合要求的探針。

可能原因 3：模板問題（包括：模板質(zhì)量不好，模板濃度太低）。

解決方法：提高模板質(zhì)量。如果懷疑模板被 DMSO 等抑制劑污染了，堅決采用乙醇沉淀；使用 104copy 的靶序列，然后在 25 到 30 個循環(huán)中獲得信號。

可能原因 4：不明物干擾。

解決辦法：做 RT-PCR 必須非常小心翼翼。對 RT-PCR 的任何實(shí)驗樣品或試劑，均應(yīng)采用“三無"離心管（即無菌無酶無熱源）進(jìn)行試劑的分裝和使用。

可能原因 5：擴(kuò)增酶問題。

解決辦法：不要省錢。買好的擴(kuò)增酶。分子生物學(xué)永遠(yuǎn)是一分價錢一分貨。推薦：選擇hot start Taq 酶進(jìn)行擴(kuò)增，可提高靈敏度，增加產(chǎn)量，降低干擾因素。

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